人elisa试剂盒操作步骤

人elisa试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入人肿瘤坏死因子α（TNF-α），再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子 α（TNF-α）呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子 α（TNF-α）含量。

操作步骤：
1、标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL；。
2、加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，然后再加待测样品 10μl（样品终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀。
3、加酶：每孔加入酶标试剂 100μl，空白孔除外。
4、温育：用封板膜封板后置 37℃温育 60 分钟。
5、配液：将 20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 20 倍稀释后备用。
6、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。
7、显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显 色 15 分钟.
8、终止：每孔加终止液 50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
9、测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

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